谈谈细胞冻存和复苏应该注意的一些事项和技巧

发布时间2018-12-25        浏览次数：672

    科幻电影中将冻存若干年的生命体重新解冻复活的情节在生命科学研究过程中每一天都在上演。为了将每一种有生命的细胞较好的保存其原有的细胞特性或者长久的保存种质资源，实验人员往往将细胞用特殊配置的细胞冻存液保存于-196℃ 的液氮，使得细胞暂时脱离生长状态，等到实验需要的时候再从液氮中取出复苏应用。在这一看似神奇的生命存储过程中，我们不禁要问，这是如何实现的呢？

    其实，细胞冻存和复苏的教科书和实验手册上面都有。小编不想再重复了。这里，我要谈谈应该注意的一些事项和技巧，大部分都是血泪教训和经验总结。都是干货哟。

    1、冷冻越慢越好，复苏越快越好
    高大上的实验室可以使用程序冷冻仪。一切由机器代劳。屌丝实验室就只好用人肉程序冷冻仪。具体的 protocol，到处都有。小编想提醒大家的是，细胞冷冻越慢越好，宁慢勿快。做细胞冷冻前，事先留出充足的时间。
    而复苏速度越快越好。从液氮罐里取出来之后，迅速放在 37°C 水浴中，然后使劲摇呀摇。令其尽快融化。

    2、高高兴兴上班，平平安安回家
    细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面*容易出事的部分。凡是和液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。*需要小心的是：复苏的时候，在水浴中摇呀摇的时候。有时候小瓶会爆炸的。所以，一定要戴保护眼镜和手套。不多说了，说多了满眼都是泪。还有，解冻之后，应不应该去除冻存液中的 DMSO 呢？答案是 Yes。为了保证细胞的正常生长，解冻后的细胞先都要经过离心，去除 DMSO 之后再加培养基继续培养，培养 24 h 之后换液，以完全除去培养基中的 DMSO。当然了，如果你买远慕的冻存液，就不存在这个问题啦。

    3、冻存细胞数量要足够
    无论再怎么小心，细胞在冷冻和复苏过程中总会死掉一批的。所以，一开始冻存细胞的数量要足够。一般要达到 5×106/毫升，一瓶不够两瓶凑。但是，这个不能一概而论。有些细胞，比如杂交瘤细胞，只需要 1-3x106/毫升。

    4、做好标记
    把培养瓶放入提手，末端应该扎有小牌，注明主人的名字，细胞名称和冻存日期。还要在每个冻存管上写上细胞名称，代数和冻存日期。
    实验室的液氮罐都是公用的。每个人应该有属于自己的提手。小编当年就发生过为了找自己的细胞，被迫把整个液氮罐翻了个底朝天的惨剧。

    5、细心呵护
    刚刚复苏的细胞就象刚刚出生的 baby，非常脆弱。需要我们的细心呵护。培养液要事先在培养箱或者水浴中复温。一切的和细胞接触的动作都要轻柔。把细胞从冻存管里吸出来，注入离心管，要轻轻地吸取和滴加。包括给离心管补加培养液的时候，都要轻轻地滴加。离心要用低速离心（500-1000 转/分钟）。吹打要用专用的吹打管，而不要图方便用移液枪，吹打也要轻轻的。

    6、DMSO 的问题
    那么，解冻之后，应不应该去除冻存液中的 DMSO 呢？答案是 no。除了少数特别注明的对 DMSO 敏感的细胞外，99% 的细胞都不需要去除 DMSO。解冻后的频繁换液会慢慢去除掉 DMSO 的。当然了，如果你买微科的冻存液，就不存在这个问题啦。

    7、物离乡贵，人离乡贱
    解冻后的细胞要用和以前一样的培养基和血清，培养基的选择非常重要，目前血清市场假货泛滥，这里小编也推荐一下上海远慕的，行货有保证。因为每一种细胞都有自己特定的，并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养基和血清，会造成细胞生长不良，甚至死亡。这和一个人突然离家千里，会水土不服是一样的道理