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原代细胞分离与培养,你都掌握了吗?

发布时间2019-09-23        浏览次数:224

       对于大部分科研人员来说,研究中一般用到均是现成的细胞系/株,我们只需要:进行细胞传代和保种。然而,这些细胞系常常由于体外长期培养,而丢失原有生物学特性,对药物处理的反应差距越来越大。因此,原代细胞的地位日渐凸显,Paper中若有了原代细胞的数据都会添色不少。然而,就小编亲生经历,原代细胞分离着实是个技术活,今天我们就结合自身经验,为大家介绍:肿瘤组织和正常组织的原代细胞的分离与培养方法。

一部分:原代细胞的基本知识

1. 什么是原代细胞培养?

       原代细胞(Primary cells):是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进行培养的细胞。这里的组织主要指:组织器官、外周血及胚胎等。

      原代细胞培养:由于原代细胞生长缓慢,繁殖一定的代数停止生长(一般10代以内)。所以一般认为:培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。

2. 原代细胞与细胞系(cell lines)的区别

原代细胞和细胞系的比较:

 

Primary  cells

Cell  lines

增殖能力

较弱

繁殖代数

一般只能传10代以内

无限增殖,50代左右

遗传物质完整性

遗传物质未改变

遗传物质发生改变

生物特性

Z接近临床样本

偏离临床样本

培养容易程度

比较复杂

简单,易操作

原代细胞和细胞系的比较

3. 原代细胞的应用

由于原代细胞生物学特性未发生很大改变,Z接近和反映体内生长特性,因此是:

(1) 研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的工具;

(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式,实现个体化精准用药的目的。

第二部分:原代细胞分离和培养技术

原代培养的原理

      将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶/胶原酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。主要包括取材——分离——培养等3部分;

在原代细胞应用较多的包括:组织器官(如实体瘤、皮肤等)、悬浮细胞的取材等。

下面依次介绍:

一、肿瘤组织的取材

病人自体的原代肿瘤细胞由于更接近临床患者标本,可以更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式,实现个体化精准用药的目的。所以对病人自体肿瘤细胞体外分离与培养十分必要。

基本过程如下图所示:

原代肿瘤细胞的分离步骤

备注:上图细胞为肉瘤患者的原代细胞

具体步骤如下:

1. 在无菌条件下的冰上对新鲜离体的肿瘤组织,剔除包膜及坏死组织,无菌PBS清洗3-5次;切成约1mm3组织块;

2. 加入2mmol 的 EDTA,摇匀后放置冰上约 30-60min;

3. 离心,并加入胶原酶消化(含蛋白酶);

4. 消化期间,置于37°培养箱。每15min摇晃一次,消化时间根据肿瘤组织来定,约1-2h;

5. 待大部分组织块消化成透明状时,用 40μm 的细胞滤网过滤细胞,收集;

6. 用培养基重悬,置于培养箱培养。