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PCR实验常见问题及其解决方案

发布时间2021-01-21        浏览次数:102

PCR产物的电泳检测时间,一般为48h以内,有些zui好于当日进行检查,大于48h后带型不规则甚至消失。
但有时仍会与到这样那样的问题,影响检测结果的判断,具体归类为以下常见的4点,描述如下:

问题一:无扩增产物
现象:正对照有条带,而样品则无。

原因:
1、模板:含有抑制物,含量低。
2、Buffer对样品不合适。
3、引物设计不当或者发生降解。
4、反应条件:退火温度太高,延伸时间太短。

对策:
1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。
2、geng换Buffer或调整浓度。
3、重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物。
4、降低退火温度、延长延伸时间。

问题二:非特异性扩增
现象:条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带。

原因:
1、引物特异性差。
2、模板或引物浓度过高。
3、酶量过多。
4、Mg2+浓度偏高。
5、退火温度偏低。
6、循环次数过多。

对策:
1、重新设计引物或者使用巢式PCR。
2、适当降低模板或引物浓度。
3、适当减少酶量。
4、降低镁离子浓度。
5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法。
6、减少循环次数。

问题三:拖尾
现象:产物在凝胶上呈Smear状态。

原因:
1、模板不纯。
2、Buffer不合适。
3、退火温度偏低。
4、酶量过多。
5、dNTP、Mg 2+浓度偏高。
6、循环次数过多。

对策:
1、纯化模板。
2、geng换Buffer。
3、适当提高退火温度。
4、适量用酶。
5、适当降低dNTP和镁离子的浓度。
6、减少循环次数。

问题四:假阳性
现象:空白对照出现目的扩增产物。

原因:
靶序列或扩增产物的交叉污染。

对策:   
1、操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
2、除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂zui好先-进行分装,然后低温贮存