技术文章
慢病毒实验相关操作方法与问题解答
发布时间2021-12-27 浏览次数：352
慢病毒载体是经过处理的HIV，理论上对人体是无害的，但病毒仍然具有潜在的生物学危险，慢病毒相关实验需要在生物安全柜（BL-2级别）内进行操作。因此在进行操作的时候，我们要按照如下基础规范进行实验：
1、在进入实验室工作时，穿着实验服或隔离服，戴上手套和口罩；
2、操作病毒时请尽量使用生物安全柜，小心不要产生气雾或液体飞溅；
3、如果使用普通超净工作台操作病毒，请在打开含有病毒的容器盖子前关闭超净台的风机（由于超净台风向外排，有可能将病毒吹向操作者），并尽快操作；尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间，封闭所有含有病毒的容器、耗材、废液后，再打开超净台风机；
4、如果操作时台面有病毒污染，请立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡过夜后弃去；
5、如需离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后离心；
6、实验结束，脱掉手套前先消毒再摘除手套，随后用肥皂洗手。
慢病毒的储存与稀释
1、病毒长期储存于-80℃冰箱，-20℃保存不要超过1周，4℃保存不要超过3天；
2、病毒的运输采用干冰，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4℃保存（于3天内用完）。若短时间内不用，收到病毒后应立即放入-80℃冰箱进行长期保存。病毒使用过程中要避免反复冻融，否则会降低病毒滴度；
3、一般病毒可在-80℃存放1年，但存放时间超过6个月后使用，需重新检测病毒滴度；
4、需要稀释病毒时，将病毒从-80℃冰箱中取出，置于冰上溶解，然后用PBS或培养基（不含血清）稀释到所需浓度后轻柔混匀，尽快使用；
慢病毒的使用
预实验摸索慢病毒的佳MOI
每种细胞对慢病毒的敏感性不同，有些容易感染，有些不容易感染，不同慢病毒的荧光强度也有差异，所以进行慢病毒操作实验之前，首先要了解MOI的概念，MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指病毒感染细胞的比例。
选择合适的MOI值，病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高，相对细胞的毒性越小。对于分裂活跃的细胞，比如293细胞MOI=1时，95%以上的细胞均可以表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低，MOI值可能达到200-300。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等）感染细胞MOI值的摸索。
1、感染前一天，一般用24孔板接种2×10?个细胞，第二天病毒感染时的细胞汇合度达到40-50%左右；
2、MOI值的设置若有文献参考，可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值，举例：文献中某细胞系慢病毒MOI值为10，则设置MOI梯度为2.5,5,10,20,40等；若无文献参考可按10倍梯度稀释进行设置，每个梯度3次重复；
注：（1）每孔加病毒量（μL）=MOI*细胞数/滴度（TU/mL）*10?
一般第二天按照细胞数倍增计算;如果病毒滴度很高，每孔加病毒量过少，可进行稀释后再加；Polybrene（常用浓度为5-10μg/mL）是否添加根据细胞种类及具体实验决定；
3、第三天（加病毒后12h-24h左右），弃去含病毒就培养基，换新鲜培养基继续培养；
4、第五天，观察荧光情况，并进行拍照，确定适合MOI值；
5、对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长病毒感染时间，根据细胞状态决定何时换培养基，保持细胞的活性。
慢病毒感染目的细胞
1、通过感染预实验，确定细胞接种密度、佳MOI等条件。正式实验前，调整并保持良好的细胞状态；
2、按实验需要将细胞铺板（qPCR检测用12孔板，WB检测用6孔板或大面积的培养皿），细胞数以第2天密度约40-50%为宜，37℃ 培养过夜；
3、感染前，从-80℃冰箱取出病毒置于冰上融化，用PBS稀释成所需浓度，用移液器吹打均匀；
4、感染前给细胞换液，然后向每孔中均匀滴加稀释好的病毒液，轻轻摇匀，37℃培养过夜；
5、感染后根据细胞状态决定，换新鲜的完全培养液，继续37℃培养。若病毒对细胞性也可不换液。感染后48-72h观测荧光，拍照记录；
6、根据需要，或收细胞抽提RNA检测目的基因在mRNA水平的表达，或收细胞抽提蛋白检测目的蛋白的表达，或收细胞进行细胞功能检测；
7、在培养过程中，需要筛选稳定携带 Puromycin 抗性基因的病毒，则需换上含适当浓度 Puromycin 的新鲜完全培养液。
慢病毒在使用过程中可能遇到的其他问题
如何使用慢病毒感染细胞？
使用慢病毒感染细胞的操作流程取决于细胞种类，因此首先要了解细胞的来源和背景。通常来讲首先要根据MOI和需要感染细胞量计算所需要的病毒量，然后将所需病毒液加入培养体系后4小时左右即可换成完全培养基正常培养。
慢病毒染后为什么细胞中出现大量黑点，并影响细胞生长？
在排除细菌及真菌污染后，细胞中的黑点通常为细胞碎片，导致细胞破碎的原因有很多，但在慢病毒感染后，细胞破碎通常有两个原因：
a. 慢病毒使用量过多，或细胞数量过少；
b. 支原体污染。由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖，故支原体污染被许多实验室所忽略。
但支原体易在病毒感染细胞后爆发，故会出现大量细胞碎片。建议在使用病毒制品时，应首先排除细胞、培养物及培养环境中的支原体污染，以节约时间。
病毒感染目的细胞感染不上或效率低？
和以下几个因素有关：
1、病毒活性：解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融， -80 ℃ 保存半年以上需要重新测滴度；
2、目的细胞：好预实验测试过，看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞，如悬浮细胞，原代细胞等，或者动物实验适合用腺病毒或AAV；
3、MOI值：一般来说MOI都是要用梯度法来摸索的，同的病毒感染不同的细胞的MOI值也不一样，如果感染细胞所用的病毒量不够的话，感染效率肯定不好；需要确认MOI计算及细胞计数的准确性。
4、感染时间：慢病毒一般在感染后24h换液，感染后换液太早会导致感染效率下降；感染后换液太晚，则对细胞的损伤太大，效率也不高。感染后48h开始观察荧光，由于慢病毒的表达时间较长，有的72h，120h才能看到荧光。
5、其他：是否加入 polybrene 以及荧光显微镜的使用等因素有关
要曝光很长时间才能观察到荧光？
要曝光很长时间才能观察到的荧光，说明荧光比较弱，可能的原因有：
1、显微镜汞灯使用时间长，这个可以通过对照排除，看是否有比较亮的对照，或者如果有其他比较亮的样品，证明不是汞灯的问题。
2、PH值低，看培养基是否发黄导致绿色荧光猝灭。
3、目的病毒光不亮，插入目的基因后的病毒荧光强度与对照相比弱一些，这个属于正常现象，增加曝光时间，看感染上的阳性细胞比例如何，看看目的和对照的荧光的差异，如果感染比例尚可，差异不是很大，用Puromycin筛选有大量细胞存活，则病毒也可以使用。