皮质醇ELISA试剂盒常见的定量方法

发布时间2017-05-31        浏览次数：1013

皮质醇ELISA试剂盒常见的定量方法
测定原理：现在皮质醇ELISA试剂盒除非是测定抗体的以外，一般使用的是双抗体夹心法，此种方法大多数用的是增强的双抗体夹心法，即使用生物素-亲和素系统，还有少数的指标可能使用竞争法，这类方法适用于半抗原的测定。
具有复杂结构的多表位蛋白抗原，其双抗体夹心法中的一个抗体必须用单抗，否则背景很高。当然如果两个都是单抗(这两个单抗针对不同表位)，那么测定的线性范围就较宽，试剂盒性能就较好；一个用单抗，一个用多抗，测定的灵敏度会较高。
某些简单的化合物用皮质醇ELISA试剂盒测定时，因为没有两个或以上的表位，一般只能作为半抗原，只能用竞争法测定。如果你发现有测定简单化合物(如雌激素、NO、地高辛等)用双抗体夹心法作测定原理时，这个试剂盒你就要怀疑了。另外还要说明一步双抗体夹心法与两步双抗体夹心法的区别。
一步双抗体夹心法的吸光度-剂量曲线呈钟形，随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hookeHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephenomenon)。所以当使用一步双抗体夹心法时，样品浓度太高，有时会出现测不出来的现象，此时要作适当的稀释才能准确测定。
皮质醇ELISA试剂盒的组成：用双抗体夹心法作为测定的方法时，试剂盒的组成一般包括：已包被单抗的酶标板：一块，有96孔的，也有48孔的，可拆缷，外面有铝箔袋密封，打开后有干燥剂，实验时暂未使用的酶标条要连带干燥剂密封好，放在4℃冰箱中妥善保存。
皮质醇ELISA试剂盒操作步骤
1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。
2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。
4、温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
6、加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。
7、温育：重复4的操作。
8、洗板：重复5的操作。
9、显色：每孔先加入显色剂A 液50μL，再加入显色剂B液 50μL，37℃避光显色15min。
10、终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。
11、测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。
12、计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。