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上海樊克详细讲述:小鼠IgGELISA试剂盒的实验方法

发布时间2017-07-03        浏览次数:592

小鼠IgGELISA试剂盒的实验方法:
基本原理:

本实验采用双抗体夹心ELISA法。用抗小鼠IgG单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的IgG与单抗结合,加入酶标抗体,形成免疫复合物连接在板上,加入酶底物TMB,出现蓝色,加终止液硫酸,颜色变黄,在450nm处测OD值,IgG浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中IgG浓度。


小鼠IgGELISA试剂盒操作步骤:
实验开始前,各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37℃溶解);试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。
1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl(在使用前一小时内配制),酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。
3.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
4.每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)100μl,酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
5.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
6.依序每孔加底物溶液90μl,酶标板加上覆膜37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
7.依序每孔加终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后立即进行检测。


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