大肠杆菌质粒DNA的提取实验

发布时间2020-07-27        浏览次数：489

实验方法原理：

碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性pH环境，DNA变性，当恢复中性并在高盐离子浓度时，大多数质粒DNA可以准确复性，留在上清中；而线性染色体DNA不能准确复性，相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质发生沉淀。离心后获得大量质粒的上清液，利用亲水性有机溶剂（乙醇、异丙-醇、PEG8000）使质粒DNA脱水，离心后收集。

实验材料 ：含质粒的大肠杆菌

试剂、试剂盒：葡萄糖 EDTA Tris-HCl NaOH SDS KAc 异戊-醇

仪器、耗材：台式高速离心机 恒温振荡摇床 高压灭菌锅 振荡器 微量移液器 1.5ml离心管

一、试剂配制

1. LB液体培养基。

2. 100 mg/ml氨苄西林储存液：称取25g的氨苄西林粉末，加去离子水至250ml，完全溶解后过滤、分装，20℃保存。

3. 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖溶液，25 mmoi/L Tris-盐酸（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8 0）。1 mol/L Tris-盐酸（pH 8.0）12.5ml，0 5 mol/L EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g；加去离子水至500ml，高压灭菌，贮存于4℃。

4. 溶液Ⅱ：0.2moI/L 氢氧-化钠溶液，1％ SDS（10 N 氢氧-化钠20 μl，10％SDS 100μl，加去离子水至1ml），使用前临时配制。

5. 溶液Ⅲ（pH 4.8）：5 mol/L 醋酸钾300ml，冰醋-酸57.5ml，加去离子水至500ml，4℃保存。

6. 苯-酚：氯-仿（1：1，V／V）（酚和氯-仿均有很强的腐蚀性操作时应戴手套！）。

7. 无水乙醇。

8. 70％乙醇。

9. RNase A（20 mg/ml）溶液：100 mg RNA酶干粉加5ml超纯水溶解，然后在沸水煮

15min，分装，20℃保存。

10. TE缓冲液：10 mmol/L Tris-盐酸（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.O）。

二、实验方法

1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含Amp 100 μg/ml）液体培养基中。37℃、250 r/min振荡培养过夜（约12——14h）。

2. 取1.5ml细菌培养液倒入离心管中，4℃、6000转离心30s，弃上清，将离心管倒置于纸巾上，去除残留液体。

3. 菌体沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，室温下放置5 min。

4. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速温和颠倒离心管5——10次，以混匀内容物，冰浴5min。

5. 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和颠倒5——10次混匀，冰浴3——5min，4℃、6000转离心5min。转移上清到一个新的1.5ml Ep管中。

6. 加入等体积的酚一氯-仿抽提剂，振荡混匀，4℃、6000转，离心2 rain。

7. 小心移出上清于1.5ml Ep管中；加入2倍体积用冰预冷的无水乙醇于室温沉淀双链DNA，混匀，室温放置2--5rain，4℃、6000转离心5min。

8. 弃上清，将离心管倒置于纸巾上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇，盖紧离心管颠倒数次，4℃、6000转，离心2min。

9. 去除所有的乙醇溶液，将管倒置于纸巾上使液体流尽，室温干燥5——10min，直到乙醇都挥发干净。

10.将质粒DNA沉淀溶于50 μl TE缓冲液（含20 μg/ml RNaseA）中，温和振荡数秒，-20℃储存备用。

注意事项：

1. 溶液Ⅰ与溶菌液充分摇匀，用力适当。因为此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，一般可用力振荡几次。

2. 加入SDS后则要注意不能过分用力振荡，温和混匀，但又必须让它反应充分。

3. 加入溶液Ⅱ混匀之后，一定要在冰上放置，不要摇动，对于溶液Ⅲ同样处