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Western Blot实验攻略,值得一看!

发布时间2020-07-28        浏览次数:20

做蛋白研究的小伙伴都知道,一个完整的Western Blot包括了很多个步骤,从蛋白提取到配胶、上样电泳,再到转膜、封闭,zui后孵育一抗二抗后才能去进行检测。时间跨度非常长,而且这中间的每一步都包含了很多的小细节,稍有不慎就会导致结果出错,然后又得从头来过。所以,关于WB,几乎每一位经验丰富的实验老手都有着一本厚厚的血泪史。

今天,小编就带领大家简要梳理一遍WB流程中的一些细节,避免因某一环节出现差错而导致实验重做。

Western Blot概述

Western Blot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物,经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物(NC膜,PVDF膜等)上后,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与其对应的抗体发生免疫反应,一抗再与酶标记的二抗体起反应,经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。



由于Western blot技术服务具有简便,快捷等特点,所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。

一:样品的获取与制备

一般来说我们检测的样品主要为细胞或者是组织,制备过程中尽量保持低温。其次在制备时一定要根据目的蛋白的特性选择合适的裂解液,比如对膜蛋白的提取、胞浆蛋白的提取和组织蛋白的提取等。

二:配胶、上样及蛋白电泳

配置凝胶时一定要将胶板清洗干净,用ddH2O或者无水乙醇润洗。晾干后根据蛋白分子量进行不同浓度凝胶配制。上样时需对蛋白进行煮沸变性,如果进行定量分析一定要将所有蛋白上样量调至相同。电泳时低压(80V)跑浓缩胶,高压(120v)跑分离胶,至溴酚蓝即将跑出胶面时终止电泳。

三:转膜及封闭

转膜时需提前配置好转膜液并低温放置。关于印迹膜来说,目前大多实验室用的是PVDF膜,根据目的蛋白大小选择合适的孔径,大于20KDa的蛋白选用0.45μm的膜,小于20KDa的蛋白选用0.2μm的膜。PVDF膜在使用时需用甲醇处理活化膜上的正电基团,使其geng容易与带负电的蛋白结合。转膜时一定要注意膜和凝胶的正反问题,除此之外一定要注意凝胶和转印膜间不要留有气泡。封闭液可选择5%的BSA或5%的脱脂奶粉,可以室温封闭1-2h或者4℃过夜封闭。封闭时一定要注意对磷酸化的抗体或生物素标记的抗体不能用脱脂奶粉封闭膜,只能用5% BSA。

四:抗体的孵育和检测

一抗二抗的选择一定要注意种属来源问题,如果这一步出错那前面的努力就相当于白费了。检测方法可以选择灵敏度超高的化学发光方法或者现在比较流行的荧光WB法。相较于传统的化学发光方法,荧光WB能够实现geng精-准的定量,还可以进行多重检测,只需要将不同的目的蛋白标记上不同的荧光就可以了。基于目前各大期刊杂志对WB发表的要求,全蛋白定量是一种新的趋势,荧光WB同样可以实现全蛋白归一化