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植物DNA提取实验,小白必看!

发布时间2020-11-26        浏览次数:128

实验方法原理

这是一种快速简便提取植物总DNA的方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨,以机械力破碎细胞壁,然后加入十六烷三甲基-溴化铵分离缓冲液,使细胞膜破裂。同时将核酸与植物多糖等杂质分开(十六烷三甲基-溴化铵,简称CTAB,是一种阳离子去污剂),再经氯-仿-异-戊醇抽提去除蛋白,即可得到适合于酶切的DNA。

实验材料 幼嫩的植物材料

试剂、试剂盒 液氮 CTAB抽提缓冲液 NaAC Tris-HCl  EDTA 氯-仿 异-戊醇 TE buffer

仪器、耗材 瓷研钵 离心管 离心机

一、实验试剂及材料

1.  材料:幼嫩的植物材料0.5g左右。

2.  试剂:液氮,CTAB抽提缓冲液:2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基-溴化铵),1%β-巯基乙醇 1.4mol/L Nacl,20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-Hcl pH8.0,3M NaAC,50mM Tris-HCl pH8.0,20mM EDTA,氯-仿:异-戊醇(24:1),异丙醇 ,70%乙醇,TE buffer。

二、实验方法

1.  取0.5 g植物材料,双蒸水洗净,并用滤纸吸干。

2.  植物材料剪成1 cm左右碎片,放入预冷的瓷研钵中。

3.  加入液氮速冷,研磨成细粉(越细越好)。

4.  在5 ml离心管中加入抽提缓冲液2.5 mll,60℃保温1小时。

5.  15 000 rpm,离心10分钟。上清转入另一个新的离心管中。

6.  加入等体积氯-仿:异-戊醇(24:1),混匀抽提至水乳胶融状。

7. 15 000 rpm,离心10分钟。

8.  上清转入另一个新的离心管中。

9.  加入2/3倍体积预冷异丙醇,-20℃保温30 min-1 h,缓缓混匀DNA成絮状折出。

10.  15 000 rpm,离心10分钟,弃上清。

11.  DNA沉淀用 70%乙醇洗2次。

12.  加入400 ul TE buffer溶解DNA。

注意事项:真核细胞基因组较大,在操作中应注意动作轻柔,且在低温下进行,以zui大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切,从而获得相对完整的DNA。

其他
以下几点可能会有所帮助: 1. 坚持使用2-巯-基乙醇和PVP; 2. 取幼嫩一点的材料; 3. 低温; 4. 快速; 5. 酚氯-仿抽提离心后, 小心吸取上清液, 求质量而不求数量; 6. 压轴的一点技巧, 酚氯-仿抽提时尽可能充分混匀。