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慢病毒的相关操作方法与问题解答

发布时间2021-07-20        浏览次数:20

慢病毒(Lentivirus)是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体,它可以感染分裂细胞和非分裂细胞,可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。此外,慢病毒具有嗜核性,可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而可以在体内较长期表达。慢病毒的多种优点,使它成为基因传递的强大而有效的工具,获得了广泛的应用。因此,慢病毒成为了实验室的一大常客。在使用慢病毒的过程中,我们会遇到一些问题,比如细胞转染效率低,细胞状态差等等。为了在实验过程中好地使用慢病毒,我们应该注意哪些问题呢?

慢病毒载体是经过处理的HIV,理论上对人体是无害的,但病毒仍然具有潜在的生物学危险,慢病毒相关实验需要在生物安全柜(BL-2级别)内进行操作。因此在进行操作的时候,我们要按照如下基础规范进行实验:

1、在进入实验室工作时,穿着实验服或隔离服,戴上手套和口罩;

2、操作病毒时请尽量使用生物安全柜,小心不要产生气雾或液体飞溅;

3、如果使用普通超净工作台操作病毒,请在打开含有病毒的容器盖子前关闭超净台的风机(由于超净台风向外排,有可能将病毒吹向操作者),并尽快操作;尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间,封闭所有含有病毒的容器、耗材、废液后,再打开超净台风机;

4、如果操作时台面有病毒污染,请立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接触过病毒的枪头,离心管,培养板,培养液请用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡过夜后弃去;

5、如需离心,应使用密封性好的离心管,或用封口膜封口后离心;

6、实验结束,脱掉手套前先消毒再摘除手套,随后用肥皂洗手。

慢病毒的储存与稀释


1、病毒长期储存于-80℃冰箱,-20℃保存不要超过1周,4℃保存不要超过3天;

2、病毒的运输采用干冰,收到病毒液后若几天内用于实验,可于4℃保存(于3天内用完)。若短时间内不用,收到病毒后应立即放入-80℃冰箱进行长期保存。病毒使用过程中要避免反复冻融,否则会降低病毒滴度;

3、一般病毒可在-80℃存放1年,但存放时间超过6个月后使用,需重新检测病毒滴度;

4、需要稀释病毒时,将病毒从-80℃冰箱中取出,置于冰上溶解,然后用PBS或培养基(不含血清)稀释到所需浓度后轻柔混匀,尽快使用;

慢病毒的使用


预实验摸索慢病毒的佳MOI

每种细胞对慢病毒的敏感性不同,有些容易感染,有些不容易感染,不同慢病毒的荧光强度也有差异,所以进行慢病毒操作实验之前,首先要了解MOI的概念,MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)是指病毒感染细胞的比例。

选择合适的MOI值,病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高,相对细胞的毒性越小。对于分裂活跃的细胞,比如293细胞MOI=1时,95%以上的细胞均可以表达目的基因。而对于非分裂细胞,比如原代细胞,感染效率较低,MOI值可能达到200-300。我们建议通过比较不同MOI(比如0、1、5、10、50、100等)感染细胞MOI值的摸索。

1、感染前一天,一般用24孔板接种2×10?个细胞,第二天病毒感染时的细胞汇合度达到40-50%左右;

2、MOI值的设置若有文献参考,可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值,举例:文献中某细胞系慢病毒MOI值为10,则设置MOI梯度为2.5,5,10,20,40等;若无文献参考可按10倍梯度稀释进行设置,每个梯度3次重复;

注:(1)每孔加病毒量(μL)=MOI*细胞数/滴度(TU/mL)*10?

一般第二天按照细胞数倍增计算;如果病毒滴度很高,每孔加病毒量过少,可进行稀释后再加;Polybrene(常用浓度为5-10μg/mL)是否添加根据细胞种类及具体实验决定;

3、第三天(加病毒后12h-24h左右),弃去含病毒就培养基,换新鲜培养基继续培养;

4、第五天,观察荧光情况,并进行拍照,确定适合MOI值;

5、对于生长缓慢代谢慢的细胞,可以适当延长病毒感染时间,根据细胞状态决定何时换培养基,保持细胞的活性。

慢病毒感染目的细胞

1、通过感染预实验,确定细胞接种密度、佳MOI等条件。正式实验前,调整并保持良好的细胞状态;

2、按实验需要将细胞铺板(qPCR检测用12孔板,WB检测用6孔板或大面积的培养皿),细胞数以第2天密度约40-50%为宜,37℃ 培养过夜;

3、感染前,从-80℃冰箱取出病毒置于冰上融化,用PBS稀释成所需浓度,用移液器吹打均匀;

4、感染前给细胞换液,然后向每孔中均匀滴加稀释好的病毒液,轻轻摇匀,37℃培养过夜;

5、感染后根据细胞状态决定,换新鲜的完全培养液,继续37℃培养。若病毒对细胞性也可不换液。感染后48-72h观测荧光,拍照记录;

6、根据需要,或收细胞抽提RNA检测目的基因在mRNA水平的表达,或收细胞抽提蛋白检测目的蛋白的表达,或收细胞进行细胞功能检测;

7、在培养过程中,需要筛选稳定携带 Puromycin 抗性基因的病毒,则需换上含适当浓度 Puromycin 的新鲜完全培养液