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核蛋白的免疫荧光定位实验

发布时间2021-07-21        浏览次数:21

实验方法原理:免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针,检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体),形成的抗原抗体复合物带有荧光素,在荧光显微镜下,由于受高压汞灯光源的紫外光照射,荧光素发出明亮的荧光,这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质,并可利用荧光定量技术计算抗原的含量,以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。

实验材料:核蛋白
试剂、试剂盒:甲醇 PB 一抗 二抗
仪器、耗材:显微镜 玻片 盖玻片 滴管

实验步骤:
1.在22x22 mm 的1.5号盖玻片上培养细胞。理想条件下细胞应长到50%~70%汇合。
2. 在-20℃用甲醇固定细胞3分钟。
3.用PBS + 1% NGS洗三次,每次10分钟。
4.在湿盒里以适当浓度的一抗室温温育1小时。
5.用PBS + 1% NGS洗三次,每次10分钟。
6.在湿盒里与稀释为4 ug/ml 的荧光标记二抗室温温育1小时。
7.用PBS洗四次,每次10分钟。
8.用封片剂将盖玻片封在载波片上,用干净的指甲油将盖玻片封边,防止盖玻片滑动。

注意事项:
1.要在盖玻片一边角落做记号,以知道细胞在盖玻片的那一面。
2.一抗的浓度需要经过实验摸索确定。
3.第四步中如果用22×22 mm 盖玻片,则在盖玻片上加30 ul 稀释的抗体,并且将盖玻片倒置在玻璃载玻片上,然后将载玻片放到湿盒里,在室温温育。

其他:
核蛋白是指在细胞质内合成, 然后运输到核内起作用的一类蛋白质。如各种组蛋白、DNA合成酶类、RNA转录和加工的酶类、各种起调控作用的蛋白因子等。核蛋白一般都含有特殊的氨基酸信号序列, 起蛋白质定向、定位作用