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慢病毒操作步骤和滴度测定注意事项

发布时间2021-07-27        浏览次数:116

(一)慢病毒安全操作规范
古朵生物慢病毒载体是第三代慢病毒载体,其 3" LTR 的增强子功能发生缺失,形成了自灭活(sefl-inactivating,SIN)的 3’ LTR, 5’LTR 中的 U3 区替换成CMV,是安全的慢病毒载体。但操作者在实验中仍需保持高度警惕,严格按照以下操作规范进行:

1.使用慢病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。
2. 请在 BL2 生物安全二级生物安全柜中操作病毒粒子。
3. 请务必穿着实验服,佩戴一次性口罩和手套。
4. 小心操作,避免产生气雾、飞溅或洒落。
5.被病毒污染的超净工作台,请立即用加入1% SDS 的 70%乙醇溶液擦拭干净;请务必 将接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液使用新配制的 10%漂、84 消毒液或
0.6%次氯酸钠溶液浸泡1 小时以上再丢弃。
6. 装盛慢病毒的实验用品需单独放置及培养,并加以标示。
7.用显微镜观察细胞感染情况时,请先拧紧培养瓶或盖紧培养板,用 70%乙醇擦拭培养 瓶外壁后,显微镜下观察拍照。观察完毕,请用70%乙醇再次擦拭显微镜实验台。
8. 离心病毒时,应使用密封性好的离心管,或用封口膜封口后进行离心,请尽量使用组织培养室内的离心机。
9. 实验完毕脱掉手套后,请立即用肥皂和水清洗双手。
10.对共用实验室的人员需进行慢病毒安全培训或提示。

(二)慢病毒感染目的细胞预实验
不同的细胞所使用的病毒 MOI 值会有所不同。建议在正式实验前,在目的细胞中进行 预实验摸索佳MOI 值(维真生物)。
为了节省病毒,推荐使用96 孔板进行预实验。操作步骤如下:

1. 天 细胞的准备
将目的细胞接种于96 孔板中,细胞融合率为 50%为佳。为保证细胞生长良好,请保 证细胞贴壁过夜。
2. 第二天 病毒的稀释
取10μL 慢病毒原液加入 90μL 培养液中做1:100 稀释(10-2),以此为起点做梯度稀 释直至稀释10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。
3. 第二天 感染目的细胞
取出提前准备好的96 孔板,用准备好的病毒稀释液替代旧培养液,注意保留未加入病 毒的细胞孔作为对照组。
4. 第二至十天 观察荧光或检测
慢病毒对细胞的感染较慢,请在感染细胞后 48、72、96、120小时分别观察细胞中荧光 表达情况(如果您选择的产品不带有荧光标签,请在 48、72、96、120小时分别收获细 胞并通过 Western-Blot 或其他检测手段来检测基因表达)。
注意事项:由于不同细胞对慢病毒感染过程的承受能力不同,在加入病毒稀释液后,
请于 12-24 小时后观察细胞状态以确认加入的病毒量是否合适。

(三)慢病毒滴度测定
维真生物慢病毒单位为TU/mL, 即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。 如:病毒滴度为>1×108 TU/mL 即每毫升病毒液中至少含有1×108个具有生物活性的慢病毒颗粒。
慢病毒的病毒滴度(TU/mL)可根据荧光蛋白在HEK293细胞中表达量确定,具体操作步骤如下:

1. 天 细胞的准备
在96孔板中的每个孔中接种1-4×104个 HEK293细胞。
2.第二天 病毒的稀释和感染。在Eppendorf管中做10倍梯度稀释。稀释方法为:每种病毒准备8个1.5mLEppendorf 管,每管加入297μL完全培养液,向个管中加入33μL病毒原液,混匀后,吸取 30μL加入第二个管混匀。依此类推,做8个稀释度(10~10-6)。弃去96孔板中原有的培养液,每个稀释度重复3个孔,每孔加入含稀释好的病毒液100μL。并做好标记。
1. 第五天 荧光计数和滴度计算
用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出后两个能观察到荧光的孔内的荧光细 胞数,计算3个重复孔内的总数之和并计算出平均数,假设为A(倒数第二个能见荧光 孔的荧光细胞平均数)和B(倒数个能见荧光孔的荧光细胞平均数)。 慢病毒病毒滴度计算公式:
病毒滴度(TU/mL) = (A+B×10)×1000/2/A孔病毒量(μL)

(四)慢病毒感染目的细胞
进行慢病毒感染实验时可使用完全培养液(培养目的细胞用)稀释。培养液中的血 清、双抗或其他营养因子不会影响慢病毒的感染效率。
以24 孔培养板为例,进行 HEK293 细胞的感染实验操作步骤如下:注意事项:实验前请按照不同的 MOI 设置不同的感染孔,并根据MOI 和细胞数量计 算所需要的病毒量。

1. 天 细胞的准备
在24 孔培养板接种若干孔,每个孔内接种 3-5×104 个HEK 293 细胞,铺板时细胞的 融合率为 50%左右,每孔培养液体积为 300μL,进行病毒感染时细胞的融合率约为70%左右。
2. 第二天 病毒的准备
根据实验的实际情况和 MOI 值,用培养液准确稀释慢病毒原液。 注意事项:可使用PBS 缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液。
3. 第二天 感染目的细胞
在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液, 混匀后放于二氧化碳培养箱(37 ℃、5%CO2)孵育过夜。

注意事项:
1)感染前细胞的状态好坏对终的感染效果高低影响很大,请务必保证加入病毒前, 细胞处于良好的生长状态。
2)若慢病毒对目的细胞的感染效率较低,可通过提高 MOI 值提高病毒的感染效率,也可在培养液中加入助感染试剂 ADV-HR(详见附录 1、附录 4、附录 5)来提高病毒的感染效率。
4. 第三天 换培养液
病毒感染细胞 24 小时后,换培养液。 注意事项:换液具体时间需视细胞状态而定。如果慢病毒对细胞有明显毒性作用,影 响细胞生长状态,短可于加病毒 4 小时后换新鲜培养液后继续培养。
5. 第六天 感染效率检测 在倒置荧光显微镜观察荧光,计算慢病毒感染目的细胞的效率。如选择的慢病毒载体 不带有荧光标记,可以通过 Q-PCR(定量 PCR)检测目的基因的表达来评估感染效率。

注意事项:
1)慢病毒表达较慢,荧光表达所需时间较长,建议感染96 小时后观察荧光的表达。
2)感染后的细胞可以连续培养一周,通过观察荧光表达的时间和强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。
3)感染期间,请根据细胞生长的情况及时换液,以保证细胞良好的生长状