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细胞培养的具体步骤,老生常谈了!

发布时间2021-09-10        浏览次数:25

具体步骤:
1、细胞复苏
将冻存细胞从液氮中取出后,在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。将融化的细胞移入离心管中,加入37oC预热的DMEM完全培养基中(其中胎牛血清约为10%),轻轻吹匀,离心,500g离心2min,弃上清液。加入DMEM完全培养基清洗,弃上清液。
加入DMEM完全培养基,轻轻吹打混匀,制成细胞悬液,接种于培养皿/瓶中,在含5% CO2的细胞培养箱中培养。

2、细胞传代
当细胞密度达到80%~90%(过早产量不足,过晚细胞状态不佳,1:2至1:10以上的比率传代培养,一般1:3至1:5细胞一代,即从细胞接种到分离再培养的一段时间,非细胞有丝分裂次数)时,去掉完全培养基,用1X PBS清洗2次。
加入胰蛋白酶(注意:消化液的量以盖住细胞好,佳消化温度是37oC。显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度)进行消化,放入细胞培养箱中约2-3min。
加入适量DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化,转移至离心管后500g离心2min,弃上清液,再加入DMEM完全培养基清洗,弃上清液。
加入DMEM完全培养基,轻轻吹打混匀,吸取10微升进行计数,然后按照所需细胞量在含5% CO2的细胞培养箱继续培养。

3、细胞冻存
当细胞密度达到80%~90%时,去掉完全培养基,用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶进行消化,放入细胞培养箱中约2-3min。加入DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化,转移至离心管后500g离心2min,弃上清液,再加入DMEM完全培养基清洗,弃上清液。加入lml冻存液(90%胎牛血清,10% DMSO。
一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整,冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养,另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质,如蔗糖,白蛋白等从而好地保护细胞),放入冻存管内(管内有异丙醇,以保证温度降低的速度),立即放入4oC冰箱中冻存30min,然后放入-20oC冰箱中冻存30min,再置于-80℃冰箱内过夜。第二天放入液氮中,可以保存至少两年,如不放人液氮,可以保存三个月。
细胞冻存和复苏的原则是:慢冻速融,这样加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂,会导致细胞内冰晶的产生,从而使细胞产生内源性的机械损伤,引起细胞内环境渗透压,PH,电解质等的改变,进而促使细胞死亡。

4、注意事项
(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热
(2)用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手;
(3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且减少污染;
(4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小;
(5)严格的无菌操作;
(6)贴壁细胞消化适度:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化;
(7)传代细胞所有的操作尽量靠近酒精灯火焰。每次好只进行一种细胞的操作,每种细胞使用一套器材。避免交叉感染;
(8)传代细胞瓶口每次打开或者关闭都需要在酒精灯上消