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mRNA的分离操作和技巧(收藏)

发布时间2021-09-18        浏览次数:109

与rRNA和tRNA不同的是,哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一 poly(A)尾,因此可以用oligo(dT)-纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等,1971;At Leder,1972)。在构建cDNA文库时, 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。

进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时,与总RNA相比,采用poly(A)+ RNA能获得为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)-纤维素,也可以买现成的产品。

1)用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)-纤维素。

2)将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中, 柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)-纤维素大量为10mg总RNA,如果总RNA的量较少,则应减少oligo(dT)-纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。

3)用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x层析柱加样缓冲液

20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)

0.5mol/L NaCl

1mmol/L EDTA(pH8.0)

0.1%SDS

可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液;将适量无 RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌,待其次序却至65℃左右时加入已在 65℃预热30分钟的10 %SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替Tris.Cl 然后用DEPC处理柠檬钠-NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。

4)用灭菌水溶解RNA,于65℃温育5分钟后使迅速冷却至室温,加等体积的2x层析柱加样缓冲液,上样,立即用灭菌的试管收集洗液。 当所的RNA溶液均进入柱床后,加1倍体积的1x层析柱加样 ,继续收集洗出液。加热RNA可以破坏可能涉及poly(A)尾的二级结构。

5)当全部溶液流出后,将收集液置于65℃温育5分钟,重新上样,并收集流出液。

6)用5-10倍柱床体积的1x层析柱加样缓冲液洗柱,分部收集洗出液,测定每一收集管的OD260。补由于不带poly)A)的RNA洗过柱床, OD260会很高,后来OD260值则很小或为零。在某些方案中,上述步骤后还用5倍柱术体积的含0.1mol/L NaCl的1x 层析柱加样缓冲液洗柱床,然而由于洗出的不带poly(A)的RNA很少甚至没有, 因此这一步骤可以省略。

7)用2-3倍柱床体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA,以1/3-1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液

10mmol/L Tris.Cl(pH7.6)

1mmol/L EDTA(pH8.0)

0.05%SDS

用于配制洗脱缓冲液的Tris. Cl 和EDTA贮存液应为新近高压的溶液 可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理,因高压会使溶产生大量气泡。

8)收集液置于透明的小溶器内,测定OD260, 使用前比色杯须用浓盐酸:甲醇(1:1)浸泡1小时,再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有RNA的洗脱组分。经上述一轮 oligo(dT)-纤维素亲和量层析后得到的RNA中,带与不带poly(A)的RNA,其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA,可将洗脱液于65 ℃温育3分钟,迅速冷却至室温,加入NaCl至终浓度为0.5mol/L,用同一oligo(dT)纤维素柱进行第二轮层析。

9)收集 oligo(dT)-纤维素柱层析的洗脱液,在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸钠(pH5.2)至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5 倍体积用冰预冷的乙醇,混匀,冰浴至少30分钟。

10)于4℃以10 000g离心15分钟回收poly(A)+RNA,小心弃去上清液,用70 %乙醇洗涤沉淀(通常看不见沉淀),离心片刻,在空气中晾干核酸沉淀。

11)用少量水重溶RNA,置于比色杯内,测定OD260, 使用前比色杯须用浓盐酸:甲醇(1:1)浸泡1小时,再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗。

12)将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内,加3倍体积乙醇, 混匀,于-70℃保存备用。回收RNA时,只需取出一小份贮存液,加3mol/K乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3mol/L, 混匀,用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。

i.OD260=1的溶液其RNA含量约为40μg/ml.

ii.从 107个哺乳动物培养细胞中可获得1-5μg mRNA,所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1-2%