慢病毒在使用过程中可能遇到的问题

发布时间2021-11-26        浏览次数：300

如何使用慢病毒感染细胞？

使用慢病毒感染细胞的操作流程取决于细胞种类，因此首先要了解细胞的来源和背景。通常来讲首先要根据MOI和需要感染细胞量计算所需要的病毒量，然后将所需病毒液加入培养体系后4小时左右即可换成完全培养基正常培养。

慢病毒染后为什么细胞中出现大量黑点，并影响细胞生长？

在排除细菌及真菌污染后，细胞中的黑点通常为细胞碎片，导致细胞破碎的原因有很多，但在慢病毒感染后，细胞破碎通常有两个原因：

a. 慢病毒使用量过多，或细胞数量过少；

b. 支原体污染。由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖，故支原体污染被许多实验室所忽略。

但支原体易在病毒感染细胞后爆发，故会出现大量细胞碎片。建议在使用病毒制品时，应首先排除细胞、培养物及培养环境中的支原体污染，以节约时间。

病毒感染目的细胞感染不上或效率低？

和以下几个因素有关：

1、病毒活性：解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融， -80 ℃ 保存半年以上需要重新测滴度；

2、目的细胞：好预实验测试过，看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞，如悬浮细胞，原代细胞等，或者动物实验适合用腺病毒或AAV；

3、MOI值：一般来说MOI都是要用梯度法来摸索的，同的病毒感染不同的细胞的MOI值也不一样，如果感染细胞所用的病毒量不够的话，感染效率肯定不好；需要确认MOI计算及细胞计数的准确性。

4、感染时间：慢病毒一般在感染后24h换液，感染后换液太早会导致感染效率下降；感染后换液太晚，则对细胞的损伤太大，效率也不高。感染后48h开始观察荧光，由于慢病毒的表达时间较长，有的72h，120h才能看到荧光。

5、其他：是否加入 polybrene 以及荧光显微镜的使用等因素有关

要曝光很长时间才能观察到荧光？

要曝光很长时间才能观察到的荧光，说明荧光比较弱，可能的原因有：

1、显微镜汞灯使用时间长，这个可以通过对照排除，看是否有比较亮的对照，或者如果有其他比较亮的样品，证明不是汞灯的问题。

2、PH值低，看培养基是否发黄导致绿色荧光猝灭。

3、目的病毒光不亮，插入目的基因后的病毒荧光强度与对照相比弱一些，这个属于正常现象，增加曝光时间，看感染上的阳性细胞比例如何，看看目的和对照的荧光的差异，如果感染比例尚可，差异不是很大，用Puromycin筛选有大量细胞存活，则病毒也可以使用。