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慢病毒在使用过程中可能遇到的问题

发布时间2021-11-26        浏览次数:86

如何使用慢病毒感染细胞?

使用慢病毒感染细胞的操作流程取决于细胞种类,因此首先要了解细胞的来源和背景。通常来讲首先要根据MOI和需要感染细胞量计算所需要的病毒量,然后将所需病毒液加入培养体系后4小时左右即可换成完全培养基正常培养。

慢病毒染后为什么细胞中出现大量黑点,并影响细胞生长?

在排除细菌及真菌污染后,细胞中的黑点通常为细胞碎片,导致细胞破碎的原因有很多,但在慢病毒感染后,细胞破碎通常有两个原因:

a. 慢病毒使用量过多,或细胞数量过少;

b. 支原体污染。由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖,故支原体污染被许多实验室所忽略。

但支原体易在病毒感染细胞后爆发,故会出现大量细胞碎片。建议在使用病毒制品时,应首先排除细胞、培养物及培养环境中的支原体污染,以节约时间。

病毒感染目的细胞感染不上或效率低?

和以下几个因素有关:

1、病毒活性:解冻病毒一定要在冰上进行,尽量避免反复冻融, -80 ℃ 保存半年以上需要重新测滴度;

2、目的细胞:好预实验测试过,看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞,如悬浮细胞,原代细胞等,或者动物实验适合用腺病毒或AAV;

3、MOI值:一般来说MOI都是要用梯度法来摸索的,同的病毒感染不同的细胞的MOI值也不一样,如果感染细胞所用的病毒量不够的话,感染效率肯定不好;需要确认MOI计算及细胞计数的准确性。

4、感染时间:慢病毒一般在感染后24h换液,感染后换液太早会导致感染效率下降;感染后换液太晚,则对细胞的损伤太大,效率也不高。感染后48h开始观察荧光,由于慢病毒的表达时间较长,有的72h,120h才能看到荧光。

5、其他:是否加入 polybrene 以及荧光显微镜的使用等因素有关

要曝光很长时间才能观察到荧光?

要曝光很长时间才能观察到的荧光,说明荧光比较弱,可能的原因有:

1、显微镜汞灯使用时间长,这个可以通过对照排除,看是否有比较亮的对照,或者如果有其他比较亮的样品,证明不是汞灯的问题。

2、PH值低,看培养基是否发黄导致绿色荧光猝灭。

3、目的病毒光不亮,插入目的基因后的病毒荧光强度与对照相比弱一些,这个属于正常现象,增加曝光时间,看感染上的阳性细胞比例如何,看看目的和对照的荧光的差异,如果感染比例尚可,差异不是很大,用Puromycin筛选有大量细胞存活,则病毒也可以使用。