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纯化凝胶选择的具体方法

发布时间2022-06-14        浏览次数:72

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性,然后通过实验选择出/有效的纯化流程。

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测定——分子量、PI

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时,可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中,可简易地测出PI,并选择纯化用缓冲液的佳PH。

选择——层析方法

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解,可尝试几种不同的纯化方法:

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">1. 使用/通用的凝胶过滤方法,选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">2.用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质,再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">3. 体积大的样品,往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品,可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理,洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。

纯化——大量粗品


portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">处理大量原液时,为避免堵塞柱子,一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAmlINE介质,直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率,缩短纯化周期。

纯化——硫酸氨样品


portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品,经处理过的样本处于高盐状态下,很适合直接上疏水层析。若作离子交换,需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术,随着介质种类不断增多,渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择/适合介质及佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。

纯水——糖类分子

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素,可结合碳水化合物的糖类残基,很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器,纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质,专为俘获整个细胞或大复合物,如膜囊等。

纯化——膜蛋白


portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者,避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质,籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。

纯化——单抗、抗原

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用,能一步纯化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理,在培养前除去IgG。重组蛋白A介质 Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有高的载量和专一性,基团脱落少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤Superdex 200,很容易去除。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">纯化IgG抗原/有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG,再进一步获取IgG抗原。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM,结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来纯化IgY,结合量达100mg纯IgY。

纯化——重组蛋白


portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物,扩张柱床吸附技术STREAmlINE便很适合做粗分离。 Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱/甘肽S转移酶一起表达,然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化,再利用凝血/酶或因子Xa切开。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达,以IgG Sepharose 6 FF纯化。