改良Lowry法蛋白定量试剂盒技术原理

发布时间2022-08-09        浏览次数：362

  关键词：蛋白定量试剂盒 标准品 96微孔板 古朵生物

  改良Lowry法蛋白定量试剂盒 规格：500T/1000T

  分类：蛋白检测

  储存条件：室温,避光，12个月

  用途：微板法,改良Lowry法定量检测蛋白浓度

  注意事项：利用蛋白中肽键与铜离子结合成四配位基铜离子复合物,后者与Folin试剂(福林酚)反应,产生蓝色比色物,用分光光度法(酶标仪或分光光度计)检测750nm处吸光度

  简介：

  目前世界上常用的蛋白浓度检测方法是：BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)和Bradford蛋白定量试剂盒(Bradford Protein Assay Kit)。改良Lowry法蛋白定量试剂盒是利用蛋白中肽键与铜离子结合成四配位基铜离子复合物，后者与Folin试剂(福林酚)反应，产生蓝色比色物，用分光光度法(酶标仪或分光光度计)检测750nm处吸光度，并与标准曲线比较，求得待测蛋白样品的浓度。在1~1500ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。

  操作步骤：

  一、准备工作

  1.制备溶液A：将16mL溶液A成分二和16mL溶液A成分三加入到装溶液A成分一的塑料瓶中，混合均匀得到240mL溶液A。注意：溶液A各成分分开提供加稳定。

  2.制备Lowry工作液：将溶液A、溶液B和溶液C按3：1：1的体积比混合得到Lowry工作液。此工作液可以室温放置2-3周，所以好用多少配多少。如果发现溶液B或溶液C有沉淀，需37℃溶解并摇匀后再使用。

  3.制备福林酚工作液：在装有10mL福林酚的棕色塑料瓶中加入90mL去离子水，摇晃混匀待用。此工作液在避光条件下可以放置6个月。

  二、试管法

  4.先用去离子水将BSA标准(2mg/mL)稀释到50μg/mL，然后在标记的试管中加入下列成分(单位：μL)。注意：每个样品好做三个稀释度，每个稀释度好设置三次重复，阴性对照和标准品也好做三次重复。

  5.每管中加入200μl Lowry工作液，振荡混匀后室温反应10分钟。

  6.每管中加入100μl福林酚工作液，振荡混匀后室温反应30分钟。

  7.用容量为0.5mL、光径为1cm的玻璃比色杯或聚苯乙烯比色杯测定750nm的光吸收。测定时，先空白(即阴性对照)后样品，测定样品和BSA标准品时，先低浓度后高浓度。测定未知样品前需要将杯子清洗干净，必要时可以用甲醇清洗吸附到比色杯壁上的染料。

  8.根据标准品三个重复的平均值绘制标准曲线，然后根据未知样品的光吸收从标准曲线中查得其对应的浓度。

  三、96微孔板法

  9.同上，只是反应用96微孔板设置，用酶标测试仪750nm测定光吸收。

  四、样品中干扰物质的去除(本产品不含相关产品，如果样品中有干扰Lowry法蛋白定量的物质，可另购本公司的微量蛋白质沉淀试剂盒去除，也可以用自备试剂按下法去除：用水将样品调到体积为200μl，加入20μl 0.15%去氧胆酸钠，混匀，室温放置10分钟。加入20μL 72%的TCA，室温放置5分钟。3000g离心15分钟，小心去除上清。用200μl水溶解蛋白沉淀后以用于Lowry法测定。

  附：常见Lowry法蛋白定量干扰物(低于所列浓度不干扰，高于所列浓度则会干扰，需要按上法去除。不能含任何浓度的DTE，DTT和硫酸胺)。

  疑难解答：

  1.该方法检测的蛋白质浓度范围1μg～50μg/ml。

  2.由于Lowry法测定的是蛋白质中酪氨酸残基，对于那些酪氨酸残基数高于或低于BSA，其测定的蛋白质含量将偏低或偏高。如果遇到该情况，需要采用BCA或Bradford法测定。

  3.阅读测定方法后化学试剂对测定方法的影响。