发布时间2022-12-02 浏览次数:305
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化,不同点如下:
1. 免疫荧光不需要使用双氧水处理,封闭和一抗孵育与其它相同。
2. 免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育,孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3. 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4. 免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油:0.01MPBS (1:1)。
5. 条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中,标本可以保存久。
6. 荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。
7. 荧光抗体染色假阳性可能会多,需要设定阳性和阴性对照。
二、注意事项
1. 荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长,会使荧光减弱。
2. 每次试验时,需设置以下三种对照:
(1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物
(2) 阴性对照:阴性血清+荧光标记物
(3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物
三、免疫荧光双标的经验之谈
1. 选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物,用来源于rabbit和rat的抗体,seco
2. 我的做法是两种primary antibodies同时孵育,然后两种seco
3. 我的阳性对照采用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4. Block用的血清使seco
5. 其余同一般操作。
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