elisa试剂盒实验中的注意事情
发布时间2023-07-10 浏览次数：111
elisa试剂盒实验中的注意事情
异常
结果描述
原因分析
对策
白板
显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。
试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用
检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。
错加、漏加试剂底物、显色剂A或B
严格按说明书的步骤操作，加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象。
洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力
确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净。
终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制
每次配制时都应看清标签标明物质。
蒸馏水有问题
确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好蒸馏水比较。
显色弱、灵敏度低
实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。
试剂盒超过期，超过有效期的产品可能会产生很弱的信号;试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响;
实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储藏。
试剂、样品用前未平衡至室温
从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡20分钟左右。
加入试剂的体积和时间有误，移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁;
确定所使用的试剂体积正确，加入时间适当。校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应完全。
洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力;
确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。
孵育时间及孵育温度未达到要求，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。
孵育温度应控制在37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。保温期内不宜多开门，以免影响保温。
洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求;洗涤冲击力太大。浸泡时间太长;
严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。
显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入;
显色剂滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不宜过快，先加显色剂A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入。
底物作用时间不够;
准确定时。
蒸馏水水质有问题;
测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。
实验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本感觉显色较弱
待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的
如有怀疑，可复检
标本加入叠氮钠作为防腐剂
酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用proclin、硫柳汞等其他防腐剂
阴阳性对照正常，但质控、参考品或个别弱阳性标本未能检出。
未达要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但质控或弱阳性标本受温度变化影响较大而被未检出。
确认孵育的温度及孵育时间达到要求。
质控品或标本高温放置过久，或被反复冻融致待测物滴度下降，而未能检出
质控品或标本避免反复冻融。标本在一周内使用的，可存于2-8℃，如需长期保存，应置于-20℃以下保存。质控品应小量分装，并置于-20℃以下保存。
仪器设定不正确，滤光片不匹配。
重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。
终止后，目测结果正常，但酶标仪读值结果偏低
酶标仪参数设定不正确。
重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。
灵敏度过高、板底高、高背景
终止后，整板结果显现均一的黄色或淡黄色;或阴阳性对照、质控正常，标本阴性标本OD值过高。
整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成，如同时操作两对半试剂时，测HbsAb板用于测HBsAg等;
实验前检查试剂的组分及批号，确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。
酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象;
避免试剂组分间的交叉污染，确保吸头、容器的干净。
显色剂在光照条件下放置过久，实验前已变蓝
显色剂A、B未使用前避光保存
孵育温度过高或孵育时间过长;
孵育温度应控制在37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。
未按要求洗板。特别是洗涤时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象
严格按说明书要求洗板。
花板，一般是由于临床标本的收集、处理和保存方法不当造成
放置时间(自然放置1~2h)及离心转速(3000r/min)、离心时间(15min)应引起注意。
出现随机性的花板、跳孔现象
样品离心不完全，反应孔内发生凝血或残留细胞成分;
充分离心，3000rpm6分钟以上。
加样时交叉污染;
加标本时尽量避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。
手工洗板造成的交叉污染
手工洗板时前3次注洗液后应立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染
洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大，造成花板、跳孔
疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要小。
拍板时交叉污染
洗板完毕拍板时用合适的吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。
假阳性
假阳性现象是一个综合现象，可参考上文“灵敏度过高、板底高、高背景"中的分析。这里只列举常见的原因及对策。
计算Cutoff值时使用的公式不正确，导致计算得出的CutOff值过低，从而导致出现假阳性
CutOff值计算公式应严格参照所属产品的说明书，应注意各个酶免产品的Cutoff值计算公式不尽相同。
洗板时未能注满洗液或洗板次数、浸泡时间不够，洗涤不充分，样品中有其他成分残留导致花板、跳孔，假阳性增多
严格按说明书要求洗板。调整洗板机时，应注意有时仪器标示的液量与实际液量并不相符，应根据实际情况调整至每孔注满。
血清标本处理不当，如未除去细胞成分、纤维蛋白原及其它干扰物可出现孔底由变蓝的跳孔现象，此标本重复实验结果往往是阴性;
放置时间(自然放置1~2h)及离心转速(3000r/min)、离心时间(15min)应引起注意。
厂家试剂质量的变化造成;
国家标准要求提高灵敏度时，厂家试剂灵敏度也相应提高，假阳率常常有所上升，但只要在合理范围，是可以接受的。
水质问题;
防止蒸馏水污染。
加酶量过多(如50uL误认为100uL)或丙肝酶稀释时加量过多;
加酶前检查移液器调节量是否准确，稀释酶时思想要集中。
培养箱温度超过37℃或酶结合物反应时间或底物显色时间超过;
放入板以前要检查培养箱的温度，准确定时。
底物配制时间过长、或底物污染;
底物应在酶反应完毕即将洗涤前5分钟配制，注意避光。
该批样品放置时间过长，样品污染;
样品应保持新鲜，或低温保存，防止污染。
移液嘴重复使用，未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物;
移液嘴尽可能一次性使用。
重复性差
1、样品数量不一，加样时间长短不一;
重复某一样品时，加样时间尽可能与次接近。
2、样品加入后未混匀;
加样后在混匀器上充分混匀。
3、酶标仪滤光片不对或输入波长不对;
TMB显色用450/630波长.
4、酶标仪测定重复性差;
校对酶标仪。
5、洗涤不正确;
洗涤液注满各孔但不要溢出。洗板时反应板面向下，垂直用力甩净内容物(可多甩几次)，在干净、无或少尘的吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔，洗涤应充分。
6、温育条件不一致(一次用水育，一次用恒温箱)
恒温箱温育较水浴显色深，OD值高出0.1-0.15,好均采用恒温箱.如用水浴水温应控制在37℃。
7、不慎多加或少加酶或显色剂;
多加时显色深，少加则浅，用记号笔圈上，便于分析。
8、阈值附近时阴时阳;
同一样品做三个复孔，以二个(含二个以上相同结果为准)
9、加样量不足、保温时间、洗涤条件一致;
尽可能使用同一移液器和装紧吸嘴重复测定标本。条件、人员等应尽量与上次保持一致。
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