技术分享：一步法反转录-荧光定量试剂盒

发布时间2023-11-13        浏览次数：95

  一步法反转录-荧光定量试剂盒

  本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time One Step RT-qPCR的专用试剂。使用本制品进行Real Time One Step RT-qPCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，避免了样品间交叉污染的同时也提高了检测的灵敏度。

  本试剂盒中的25×RT-PCR Enzyme Mix为TIANGEN新型逆转录酶(FastKing RTase)、新型抗体修饰热启动Taq DNA聚合酶和RNase Inhibitor的预混Mix形式，其中的FastKingRTase，是分子改造后的新型逆转录酶，特别增加了疏水motif，具有强的RNA亲和性和热稳定性，提高了该酶的逆转录效率和对具有复杂二级结构RNA模板的延伸能力;PCR过程中采用了性能优良的新型热启动Taq DNA聚合酶，使得逆转录后的PCR反应具高的扩增效率和特异性。另外，本产品中的2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)是专门为上述两种关键酶而优化的新型反应体系，其中包含必要离子组分、dNTPs、SYBR Green染料以及One Step 稳定剂和增强剂，可保证FastKing RTase和新型热启动Taq DNA聚合酶在整个一步法反应过程中发挥优良功效。

  本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对多种高低丰度的靶基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。

  产品特点：

  提高反应效率：性能优良的逆转录酶和Taq酶保证了高的反应效率;

  操作简单快速：双组分的产品形式使得操作过程变得简单快速;

  通读复杂模板：能够作用于GC含量高，二级结构复杂的RNA模板;

  样品普适性高：对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高。

  用户自己需要准备的

  1. 引物;

  2. 模板;

  3.一次性手套及其它耗材;

  适用范围

  RT-qPCR技术可用于检测细胞和组织中的基因表达水平及RNA病毒的含量。

  操作步骤

  1. 完全融化模板RNA，特异性引物，2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)，50×ROX Reference Dye和RNase-Free ddH2O，短暂离心后置于冰浴上。

  2. 按下表在冰浴条件下配制反应液：

  组成成分 体积/反应

  2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green) 25 µl

  25×RT-PCR Enzyme Mix 2 µl

  上游特异性引物(10 µM) 1.25 µl*1

  下游特异性引物(10 µM) 1.25 µl*1

  RNA模板 10 pg-1 µg total RNA

  50×ROX Reference Dye*2 根据不同仪器添加

  RNase-Free ddH2O 补水至50 µl

  总体系 50 µl

  *1 引物终浓度为0.25 µM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度;发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.05-0.90 µM范围内调整。

  *2 几种常见仪器的匹配ROX Reference Dye浓度见下表：

  仪器 终浓度

  ABI 5700/7000/7HT/StepOneTM/

  StepOne PlusTM

  5×(例如：5 µl ROX/50 µl体系)

  ABI 7500、7500 Fast、ViiA 7、QuantStudio 、

  12K Flex;Agilent Mx3000P、Mx3005P和Mx4000 1×(例如：1 µl ROX/50 µl体系)

  Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等 不用添加

  3. 进行Real Time One Step RT-qPCR反应

  PCR反应管请用离心机瞬时离心后放入荧光定量PCR仪中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的标准PCR反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。

  注意事项

  1. RNA 模板可以采用总RNA 或mRNA，建议使用TIANGEN公司生产的TRNzol，RNAprepPure或RNA Easy Fast系列制备高质量的总RNA。

  2. 一步法RT-qPCR实验应避免RNase污染，可采用以下措施：

  1) 因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应佩戴一次性手套和口罩;

  2) 一步法RT-qPCR实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA;

  3) 一步法RT-qPCR实验相关耗材应用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12 h，并高压灭菌30 min后使用。

  3. 25×RT-PCR Enzyme Mix在取用之前应短暂离心收集溶液后再吸取，吸取时动作要慢，使用后应尽快放回-20℃。

  4. 2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)在取用前应充分混匀并离心后使用。

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