发布时间2023-11-22 浏览次数:83
ELISA实验注意事项以及常见问题解答
酶联免疫吸附测定(ELISA)被称为免疫测定金标准。是一种免疫学测定方法。ELISA是用于测定抗原抗体,根据样本不同的类型和检测方法来进行相应的制定。主要类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、双抗原夹心法。
双抗体夹心法是常用的ELISA检测类型,它是利用一个抗体进行捕获,另外一个抗体进行检测。双抗体夹心法具有高特异性和高灵敏度,非常适用于复杂样本,但夹心法通常检测时间较长,难度大于其他方法。
一、双抗夹心法实验步骤:
二、双抗夹心法实验操作注意事项:
1、样品稀释:
(1)稀释血清避免假阳性的发生(把蛋白按照一定的倍数稀释,如10倍、20倍,将抗原进行稀释包被反应;用稀释好的阳性参阅血清和阴性参阅血清进行孵育后洗刷,加入酶结合物进行反应,孵育洗涤,加入底物显色,停止反应后分别测定O.D值,O.D值≥1.0的抗原稀释度为适合的包被浓度。阴性参阅血清O.D值<0.1-0.2。这样阳性参阅血清和阴性参阅血清的O.D值就会有明显差别)。
(2)粉末型样本需要短暂离心,如沾到管盖、管壁需要将标准品沉入管底;加入蒸馏水时需短暂轻柔涡旋,静置10-30min,充分溶解。
(3)加水后等待充分溶解后可选择吸吹或涡旋混匀。
2、试剂平衡:
(1)所有的试剂和样本需平衡至室温5-10min,避免产生动力学反应差异这会影响准确性。
3、混匀:
(1)稀释前、后的样品需进行摇床充分混匀。
4、加样操作:
(1)定期校准移液抢。
(2)加样前需混匀,避免加入到孔壁上,尽可能避免气泡产生。
(3)避免样本溅出(可用吸水纸吸取溅出液体)。
(4)避免加样枪头反复吸取导致样本污染。
(5)加样操作按照说明书的顺序来进行,确保显色时间一致。
5、孵育:
(1)震荡孵育,加快抗原抗体之间的相互接触,使反应加充分。
(2)水浴温度保持37℃。
(3)水浴需要封闭防止污染。
6、洗板:
(1)洗液尽量不要溢出孔外。
(2)拍过酶标记物后及时换吸水纸,避免影响实验的准确性。
(3)手工洗板时拍板要垂直且用力不能过猛,可避免交叉污染。
(4)扣干后的酶标板应快速加液,避免干板太久。
(5)采用全自动时需检查各项水瓶是否充足。
(6)采用全自动时检查是否堵塞。
7、显色:
(1)显色需控制好时间(根据说明书操作),时间过短,结果偏低;时间过长,空白增高/非特异性显色增加。
(2)显色呈梯度。
8、比色:
(1)跟换滤光片时注意错用的可能性。
9、检测:
(1)酶标仪使用前预热10-15min,结果稳定。
(2)双波长测定吸光值,可以减少指纹、杂质等带来的误差(检测波长450nm-参考波长630nm(570nm))。
二、试剂盒选择注意事项:
1、选择明确:
(1)样本种属类型
(2)样本类型:
2、样品中检测物水平选择:
(1)宽动力学检测范围:对样品种待测物水平没有任何参考数据。
(2)高灵敏度试剂:待检物含量很低。
3、样品获得性选择:
(1)通常试剂盒的样品用量在40μL或100μL,少部分用量20μL左右。
4、试剂盒技术参数选择:
(1)回收率达到80-120%之间。
(2)按照标准示值误差:100μg。
(3)误差系数<5%-8%。
(4)建议优先考虑双单抗。
(5)操作方便
三、常见问题解答:
1、样本的处理、收集和保存问题:
(1)细胞培养上清通过离心收集,分装保存,温度-20℃。
(2)血清样本分离管分离血清,样本凝集30min后离心,吸取血清立即检测,分装保存,温度-20℃。
(3)血浆样本采用EDTA收集样本,需在30min内离心,吸取样本立即检测,分装保存,温度-20℃。
(4)避免选择严重溶血或高血脂样本,收集后快速检测并储存,若未能在24h内检测,可暂时存放2-8℃。
(5)分析前样本需缓慢恢复至室温,注意是否有沉淀物需祛除干净。
2、样本反复冻融,具有哪些影响:
(1)蛋白易降解。
(2)细胞上清冻融1-2次后,蛋白降解严重。
3、阴性对照和空白对照的区别:
(1)空白对照:稀释液代替样本,检测显色本地,读取阳性、阴性、样本孔的吸光值。
(2)阴性对照:样本与待检测物具有同源、同质性,但不含有待检测物质,可鉴别处理因素之间的差异性。
4、添加显色后,无色或阳性对照弱:
(1)试剂盒需采用同批次。
(2)注意稀释倍数是否正确。
(3)酶结合物是否未添加。
(4)试剂是否添加错误。
(5)显色液是否变质。
(6)确认各项容器干净无污染。
(7)注意配置时看清标签和说明书。
(8)观察液面高度是否一致,避免试剂漏加。
5、样本浓度不正确:
(1)标曲是否适合,有无失效等。
(2)样本含量或灵敏度较低无法被检测到,浓缩样本。
(3)样本含量或灵敏度较高,超过标曲浓度需稀释样本。
6、为什么吸光值过高:
(1)若如值正确,则显色过高。
(2)波长选择错误,可选择双波长检测。
7、为什么吸光值低:
(1)样本未充分溶解,(混匀后需静置30min)。
(2)样本反复冻融,活性减弱。
(3)孵育的温度和时间为满足要求(按照说明书操作)。
8、无梯度:
(1)样本污染,需要跟换样本。
(2)稀释倍数错误,重新做。
(3)抗体浓度高,换抗体或稀释。
(4)底物孵育是否时间和温度过短。
(5)孵育需封盖。
实验结果汇总事项:
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