知识详解：细胞裂解的方法你知道吗?

发布时间2023-11-24        浏览次数：68

  细胞裂解的方法你知道吗?

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  对于培养细胞样品:

  1.融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的Zui终浓度为1mM.

  2.对于贴壁细胞:去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解.

  对于是浮细胞:离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔L板每孔细胞加入150-250微升烈解液的比例加入裂解液再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。

  3.充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Wester和免疫沉淀等操作.烈解液用量说明:通常63板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。

  在试验中，不同的细胞采用不同的裂解方法。如研磨，细胞匀浆，TritonX 100，稀减法等等。那么，具体该怎样选择细胞的裂解方法? 本节内容主要围绕组织样本裂解细胞的方法做详细介绍。

  1.把组织剪切成细小的碎片

  2.融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的zui终浓度为1mM。

  3.按照每20室克组织加入150-250微升烈解液的比例加入烈解液。(如果烈解不充分可以适当添加多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)

  4.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解

  5.充分烈解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作.

  6.如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分，然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

  注:RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验，如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappab、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

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