1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2、温育：用封板膜封板后置 37℃温育30分钟。

3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此

重复5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

10 分钟.

7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

兔子Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)ELISA试剂盒操作步骤注意事项：
(1).实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
(2).试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
(3).使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器 。
(4).不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
(5).洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
(6).使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
(7).加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
(8).按照鸡血红蛋白(HB)ELISA检测试剂盒说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
(9).底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。


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