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产品名称: HYDS0034-100T 四色多重免疫荧光试剂盒(三标四色)
产品型号: HYDS0034-100T
品牌: 1495
产品数量:
产品单价: 1.00
日期: 2022-06-14

HYDS0034-100T 四色多重免疫荧光试剂盒(三标四色)的详细资料

免疫荧光(immunofluorescence,IF),通常是指用荧光标记的抗体示踪或检查样品中相应抗原的方法。根据抗原抗体反应,将不影响抗原抗体相互作用的荧光分子标记在抗体上,与其相应的抗原反应后,在荧光显微镜下针对荧光标记分子的激发光发射光进行观察,从而检测目的指标的相对含量、在组织细胞中的定位。

产品名称:四色多重免疫荧光试剂盒(三标四色)

原理介绍:酪酰胺信号放大(TSA,Tyramidesignalamplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法,类似常规免疫组化的DAB显色方法,TSA 技术同样采用HRP标记的二抗,同样有对应的“显色”步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物,产生活化荧光底物,活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合,使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物,重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育,换另一种酪胺荧光素底物,如此往复就可实现多重标记。
TSA详细原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点),产生大量的酶促产物,该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合,这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积,结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说,用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP(而不是直接偶联荧光素),来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化,跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联,使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理,前一轮非共价结合的抗体被洗掉,共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育,周而复始。等到所有抗体孵育结束,荧光素都结合好后,最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育,因此无需担心抗体交叉反应,以及一抗二抗种属匹配问题,大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说,如果用TSA技术,同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验,而且信号放大的倍数大大增强。本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种:480,520,570,620,690,780,488,CY3.此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能,极大丰富了此试剂盒的内涵。

产品名称:四色多重免疫荧光试剂盒(三标四色)
试剂盒组成:488荧光染料(绿光)(即用型,5mL),-20℃;CY3荧光染料(红光)(即用型,5mL),-20℃;TSA+增强剂,100ul,-20℃(可选);
高敏多聚hrp山羊抗兔二抗(5mL)4℃。
备注:488荧光染料、CY3荧光染料在-20度下,均为固体,使用之前需解冻。


TSA+增强剂使用方法:TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号放大液的放大信号5-10倍,TSA+增强剂:荧光放大液=1:500,使用TSA+增强剂不是必须的选项,可以根据具体的情况选择添加
或者不选择添加。
操作流程:
1、石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ。取出放在通风厨内,酒精晾干后放入自来水中稍洗,蒸馏水洗。
2、抗原修复:组织切片置于盛满PH9.0EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复(也可以用高压1-2min100度水煮15min95度水浴20min等其他热修复方法)。中火8min,停火8min,转中低火7min,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定)。
3、阻断内源性过氧化物酶:切片放入3%过氧化氢溶液,室温避光孵育15min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。
4、BSA封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走),在圈内滴加用3%BSA-PBS(或者其他封闭液)均匀覆盖组织,室温封闭30min。
5、加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X,切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37度1-2h。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
6、加hrp二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织,避光室温孵育50min,PBS洗三次。
7、荧光染料反应:488荧光染料(或者CY3荧光染料)反应10-15min,PBS洗三次。
8、重复2-7步骤(换用另外一种荧光染料)
9、DAPI复染细胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。
10、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
11、镜检拍照:切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。


染料 激发波长 发射波长
DAPI蓝色 350 420
480 450 480
488绿色 480-490 512-520
CY3红色 530-550 570-590
520绿色 490 520
570红色 550 570
620 590 620
690 630 690
780 750 780

产品名称:四色多重免疫荧光试剂盒(三标四色)