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产品名称: HYDS0045-100T 五色多重免疫荧光试剂盒(四标五色)
产品型号: HYDS0045-100T
品牌: 1495
产品数量:
产品单价: 1.00
日期: 2022-06-14

HYDS0045-100T 五色多重免疫荧光试剂盒(四标五色)的详细资料

免疫荧光(immunofluorescence,IF),通常是指用荧光标记的抗体示踪或检查样品中相应抗原的方法。根据抗原抗体反应,将不影响抗原抗体相互作用的荧光分子标记在抗体上,与其相应的抗原反应后,在荧光显微镜下针对荧光标记分子的激发光发射光进行观察,从而检测目的指标的相对含量、在组织细胞中的定位。
产品名称:五色多重免疫荧光试剂盒(四标五色)

原理介绍: 酪酰胺信号放大(TSA, Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶 ( HRP) 对靶蛋白进行标记的酶学检测方法, 类似常规免疫组化的 DAB 显色方法 , TSA 技术同样采 用 HRP 标记的二抗, 同样有对应的 “显色”步骤 (HRP 催化加入反应体系的酪胺荧光素底物, 产生  活化荧光底物, 活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合, 使样品上稳定的共价结合酪胺荧光    素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP 复合物, 重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵 育, 换另一种酪胺荧光素底物, 如此往复就可实现多重标记。
TSA 详细原理是利用酪胺 Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在 HRP 催化 H202 下形成共价键结合位点), 产生大量的酶促产物, 该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、  组氨酸和酪氨酸残基)结合, 这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积, 结果使其检测信号得到 10-100 倍增强。  简单  来说, 用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的 HRP (而不是直接偶联荧光素) , 来催化后续 添加入体系的非活性荧光素。  荧光素在 HRP 和过氧化氢的作用下被活化, 跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联, 使得蛋白样品与荧光素稳定结合。  然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理, 前一轮非共价 结合的抗体被洗掉, 共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。  再换个一抗来第二轮孵育 , 周而复始。  等到所有抗体孵育结束, 荧光素都结合好后, 最后去检测结果。  由于每次体系中都只有单 一抗体孵育, 因此无需担心抗体交叉反应, 以及一抗二抗种属匹配问题, 大大减少了实验设计时不同 种属抗体选择匹配的限制。  也就是说, 如果用 TSA 技术, 同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性 高的兔单克隆抗体。  搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以进行实验, 而且信号放大的倍数大大增强。    本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种:  480, 520, 570 , 620,690,780。 此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。  可以实现单标、  双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能, 极大丰富了此试剂盒的内涵。

产品名称:五色多重免疫荧光试剂盒(四标五色)
试剂盒组成:  520 荧光染料(绿光)(即用型, 5mL),-20℃;  570 荧光染料 (红光)  (即用型 ,  5mL), -20℃;   690 荧光染料(即用型, 5mL), -20℃;  TSA+增强剂, 100ul,  -20℃ (可选) ; 高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 (5mL) 4℃。 备注:  520 荧光染料 、 570 荧光染料 、 690 荧光染料 在-20 度下, 均为固体, 使 用之前需解冻。
TSA+增强剂使用方法:  TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号放大液的放大信号 5-10 倍, TSA+增 强剂:   荧光放大液=1:500, 使用 TSA+增强剂不是必须的选项, 可以根据具体的情况选择添加 或者不选择添加。

产品名称:五色多重免疫荧光试剂盒(四标五色)
操作流程:
1、 石蜡切片脱蜡至水:  依次将切片放入二甲苯 Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇 Ⅰ5min-无水乙醇 Ⅱ。 取出放在通风厨内, 酒精晾干后放入自来水中稍洗, 蒸馏水洗。
2、 抗原修复:  组织切片置于盛满 PH 9.0 EDTA 碱性抗原修复液或者 PH6.0 柠檬酸修复缓冲液的修复 盒中于微波炉内进行抗原修复 (也可以用高压 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 热修复方法)  。 中火 8min, 停火 8min, 转中低火 7min, 此过程中应防止缓冲液过度蒸发, 切勿 干片。  自然冷却后将玻片置于 PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次, 每次 5min。 (修复液 和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定)  。
3 、 阻断内源性过氧化物酶:  切片放入 3%过氧化氢溶液, 室温避光孵育 15 min, 将玻片置于 PBS (PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次, 每次 5min。
4、 BSA 封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈 (防止抗体流走) , 在圈内滴加用 3%BSA-PBS (或者其他封闭液) 均匀覆盖组织, 室温封闭 30min。
5、 加一抗:  轻轻甩掉封闭液, 在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗 X, 切片平放于避光湿盒 内 4°C 孵育过夜或者 37 度 1-2h。 (湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
6、 加 hrp 二抗:  玻片置于 PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次, 每次 5min。 切片稍甩干后 在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织, 避光室温孵育 50min, PBS 洗三次。
7、 荧光染料反应:  XXX 荧光染料反应 10-15min, PBS 洗三次。
8、 重复 2-7 步骤 (换用另外一种 XXX 荧光染料)
9、 DAPI 复染细胞核:  玻片置于 PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次, 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈内滴加 DAPI 染液, 避光室温孵育 10min。
10、    封片:  玻片置于 PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次, 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 荧光淬灭封片剂封片。
11、    镜检拍照:  切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图 像。
染料 激发波长 发射波长
DAPI 蓝色 350 420
480 450 480
520 绿色 490 520
570 红色 550 570
620 590 620
690 630 690
780 750 780